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副豬嗜血桿菌河南分離株的分離鑒定及藥敏試驗

所屬欄目:細菌性病 文章來源:三五養豬網 發布時間:2019-04-25 16:00:15 字號切換:T|T

  副豬嗜血桿菌(HPS) 是一種多形態、非溶血性、不運動、NAD 依賴型、革蘭氏陰性細小桿菌,屬于巴斯德桿菌科嗜血桿菌屬。副豬嗜血桿菌只感染豬,有很強的宿主特異性,可以影響2 周齡到4 月齡的青年豬,主要在斷奶后保育舍階段發病,感染高峰通常見于保育期的4 ~ 6 周,發病率一般在10% ~ 15%,嚴重時病死率可達50%。副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌引起的豬的一種以急性敗血癥、多發性漿膜炎和關節炎為特征的細菌性傳染病。該病為繼發性疾病,常在藍耳病病毒、圓環病毒等病毒感染后激發帶菌豬和慢性感染豬發病,成為本病的傳染源,病原菌主要存在于豬的上呼吸道,通過豬之間的接觸、空氣飛沫及污染物而傳播。在集約化豬場中, 當豬群遭受環境不良、轉群、去勢、免疫注射、飼養不當等應激因素影響, 或者豬群感染豬繁殖與呼吸綜合征等免疫抑制性疾病時, 副豬嗜血桿菌病伺機暴發, 造成嚴重的經濟損失 。目前, 該病已成為全球范圍內影響養豬業的典型細菌性疾病。

  在特定的條件下引起豬的多發性漿膜炎和關節炎,主要臨床癥狀為發熱、食欲不振、厭食、反應遲鈍、咳嗽、呼吸困難、疼痛( 尖叫)、關節腫脹、跛行、顫抖、共濟失調,可視黏膜發紺、側臥、消瘦和被毛凌亂隨之可能死亡。種豬急性感染后可能留下后遺癥,即母豬流產,公豬慢性跛行。特征性病理變化為胸腔、腹腔漿膜及肺部炎癥,胸腔內有大量的淡紅液體及纖維素性滲出物。肺表面覆蓋有大量的纖維素性滲出物并與胸壁粘連,多數為間質性肺炎,部分有對稱性肉變。各臟器有不同程度的出血、淤血和壞死。鏡檢滲出物中有大量纖維蛋白、中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞和單核細胞。實質細胞呈現不同程度的顆粒變性、水泡變性和壞死,實質和間質可見充血、出血、炎性細胞浸潤、纖維性滲出和水腫液蓄積。

  近年來,副豬嗜血桿菌病在國內豬場引起多發性漿膜炎和關節炎的報道屢見不鮮,其發病率和死亡率日漸升高。為此,本實驗對河南省內疑似病例進行病原分離培養,以對本病藥物防控中藥敏檢測及其滅活菌苗研制奠定基礎;本實驗還采用病原學和生化鑒定診斷, 并進行藥敏試驗, 以期為該病的診治提供臨床依據。

  1 材料與方法

  1.1 材料

  1.1.1 病料采集

  對河南某豬場的15 頭疑似副豬嗜血桿菌感染的病仔豬進行病理剖檢。無菌條件下抽取心血、心包液和腹水,并采集病變明顯的肺、心、腎臟等病料進行病原學檢查。

  1.1.2 菌種與主要培養基

  金黃色葡萄球菌,各種藥敏試紙片(左旋氧氟沙星、恩諾沙星、磺胺間甲氧嘧啶、乳酸環丙沙星、氟苯尼考、頭孢噻呋鈉、克林霉素、硫酸慶大霉素、氟哌酸、替米考星、阿莫西林、鹽酸林可霉素、氨芐西林、青霉素鉀等);煙酰胺嘌呤二核苷酸、美蘭染色、革蘭氏染色、HE 染色試劑,普通營養瓊脂平板、麥康凱培養基、綿羊鮮血瓊脂平板、加NAD 的巧克力瓊脂平板和TSA 培養基、TSB 液體培養基均自制。

  1.1.3 生化鑒定微量發酵管及試劑

  葡萄糖發酵管、蔗糖發酵管、甘露糖發酵管、木糖發酵管、棉籽糖發酵管、甘露醇發酵管、硫化氫微量發酵管,氧化酶、3% 過氧化氫、硝酸鹽培養基。

  1.2 方法

  1.2.1 細菌的分離培養

  無菌操作條件下, 采集病豬的心血、心包液、腹水、肺、心、腎臟等病料,首先劃線接種于含NAD 的巧克力瓊脂平板或TSA 培養基上,37 ℃培養48 h,然后挑取單個菌落進一步純化培養。

  1.2.2 染色鏡檢

  將培養后的單個疑似菌落涂片,進行美蘭染色和革蘭氏染色, 鏡檢,觀察菌體形態及染色特性。

  1.2.3 培養特性

  取疑似副豬嗜血桿菌菌落分別接種于普通營養瓊脂平板、麥康凱培養基、綿羊鮮血瓊脂平板、含NAD 巧克力瓊脂平板和TSA 培養基,37℃恒溫培養48 h, 觀察菌落的生長情況。

  1.2.4 生化鑒定

  糖類分解試驗:取純培養后的細菌分別接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖發酵管內,倒置于潔凈的小燒杯內,置滅菌培養皿中。37 ℃培養24 h,觀察并記錄結果。結果判斷:無變化,培養液仍為紫色,陰性反應;產酸,培養液為黃色及產酸又產氣,培養液變黃,并有氣泡,陽性反應。

  硫化氫試驗:取純培養的細菌接種于硫化氫微量發酵管,置于37 ℃培養24 h 后觀察,培養液黑色者為陽性,無色者為陰性。

  氧化酶試驗:加2 ~ 3 滴試劑于濾紙上,用牙簽挑取1個菌落到紙上涂布, 觀察菌落反應。陽性反應在5 ~ 10 s 內由粉色到黑色,15 min 后可出現假陽性反應。也可以將試劑滴在細菌的菌落上,菌落成玫瑰紅然后到深紫色者為陽性。

  觸酶試驗:可用接種環將菌落放于載玻片的中央,加1 滴3% 過氧化氫于菌落上,立即觀察有無氣泡出現;也可以直接將3% 過氧化氫滴加到菌落上觀察有無氣泡出現。

  硝酸鹽還原試驗:把純菌接種到硝酸鹽培養基中,在37 ℃ 培養18 ~24 h,再加試劑甲(對氨基苯磺酸0.8 g+5 mol/L 醋酸100 mL)和乙(α-奈胺0.5g +5mol/L 醋酸100mL) 各3 ~ 5 滴,在30 s 內出現紅色即為陽性。若無顏出現,加少量鋅渣,隨后出現紅色則是真正的陰性試驗。

  1.2.5衛 星現象觀察

  挑取經純化培養的可疑菌落, 于綿羊鮮血瓊脂平板上水平畫線,再挑取金黃色葡萄球菌垂直劃線,37 ℃培養24 ~ 48 h, 觀察是否有衛星生長現象。

  1.2.6 動物試驗

  將純化菌接種于TSB 液體培養基,18 h 后經菌落計數,將培養液稀釋成每毫升含2×105 個菌,皮下注射0.2 mL稀釋液于小白鼠。

  1.2.7 藥敏試驗

  將培養純化的菌種均勻涂布于含NAD 的巧克力培養基上,然后按常規紙片法,將各種藥敏試紙片(左旋氧氟沙星、恩諾沙星、磺胺間甲氧嘧啶、乳酸環丙沙星、氟苯尼考、頭孢噻呋鈉、克林霉素、硫酸慶大霉素、氟哌酸、替米考星、阿莫西林、鹽酸林可霉素、氨芐西林、青霉素鉀等)貼于平板上,37 ℃恒溫培養18 ~ 24 h,觀察抑菌圈大小。

  判定標準: 抑菌圈直徑大于15mm 為高度敏感;抑菌圈直徑在10 ~ 15 mm 之間為中度敏感;抑菌圈直徑小于10 mm 為耐藥。

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